《重組DNA技術》PPT課件.ppt

第40章、重組DNA技術,1. 目的基因的獲取 2. 克隆載體的選擇與構建 3. 外源基因與載體的連接 4. 重組DNA導入受體菌 5. 重組體的篩選 6. 克隆基因的表達,(一)目的基因的獲取,化學合成法 基因組DNA cDNA 聚合酶鏈反應,基本概念,基因（gene）：P219 基因組（genome）：P292 基因組學（genomics）： 研究基因組的結構、信息與功能的科學。 基因組計劃：HGPP440 后基因組 功能基因組,基因文庫,基因組DNA文庫 (genomic DNA library) cDNA文庫 (cDNA library),聚合酶鏈反應（PCR）,Polymerase Chain Reaction 基本原理： 變性、 退火、 延伸,(二)克隆載體的選擇和構建,質粒DNA 克隆載體 噬菌體DNA 病毒DNA,(三) 外源基因與載體的連接,連接策略 1. 粘端DNA間的連接 (1) 同一限制性內切酶切割位點連接 (2) 不同限制性內切酶切割位點連接 2. 平端DNA間的連接 3. 同聚物加尾連接 4. 人工接頭連接,(四)重組DNA分子導入受體菌,無性繁殖 感受態細胞: 容易接受外源DNA的狀態. 方式: 轉化、轉染、感染,導入大腸桿菌 1. 氯化鈣轉化法 2. 電擊法 3. 體外包裝感染法,導入哺乳動物細胞 1. 顯微注射法 2. 電穿孔法 3. DNA-磷酸鈣共沉淀 4. DEAE-葡聚糖轉染法 5. 病毒感染法 6. 脂質體介導法 7. 細胞融合法 8. 原生質體融合法 9. 微細胞介導法,(五)重組體的篩選,直接選擇法 1. 抗藥性選擇 2. 標志補救 3. 分子雜交法,間接篩選法,核酸水平 *1. 酶切圖譜 *2. 核酸探針 *3. PCR *4. 序列測定,蛋白質水平 免疫學的技術： SDS-PAGE、Western blot、ELISA、放免、免疫沉淀、 熒光抗體等,抗藥性篩選重組體,(六)克隆基因的表達,原核表達體系表達載體的標準： 1. 含有大腸桿菌適宜的選擇標志 2. 具有能調控轉錄、產生大量mRNA的強啟動子 3. 含有適當的翻譯控制序列 4. 含有合理設計的多接頭克隆位點,真核表達體系 關鍵步驟是將重組DNA導入真核細胞,DNA克隆的基本過程,分：分離目的基因 切：對目的基因和載體適當切割 接：目的基因與載體連接 轉：重組DNA轉入受體菌 篩：篩選出含有重組體的受菌體,基因工程技術策略,分： 基因載體 目的基因 質粒 噬菌體 病毒 直接分離 cDNA 人工合成 基因文庫 切： 限制性內切酶 有缺口的載體 目的基因 接： 連接酶 粘端連接 平端連接 尾接法 重組體 轉： 轉化 轉染 體外包裝 帶重組體的宿主 篩： 表型篩選 電泳法 核酸雜交,基因工程技術與醫學的關系,1.生命科學研究的趨勢 2.疾病基因的發現 3.發展生物制藥 4.基因診斷與基因治療 5.遺傳病的預防,基因工程的目的,醫學用途: 超過種基因治療法已經在全球推行 改善農業: 糧食產量大增，解決飢荒；抵抗病蟲害，耐寒耐旱，防止早熟和腐爛，保存期更長。 稀有動物的保育: 拯救瀕臨絕種的動物 其他:政治用途、經濟用途、娛樂用途等。,轉基因作物，目前最常見的是轉入抗除草劑基因，這樣的轉基因作物可以抵抗普通的、較溫和的除草劑，因此農民用這類除草劑就可以除去野草，而不 必采用那些毒性較強、較有針對性的除草劑。 其次是轉入抗蟲害基因，用得最多的是從芽孢桿菌克隆出來的一種基因，有了這種基因的作物會制造一種毒性蛋白，對其他生物無毒，但能殺死某些特定的害蟲，這樣農民就可以減少噴灑殺蟲劑。據統計，在過去的四年內，美國由于推廣抗蟲害轉基因作物，少噴灑 了270萬磅的殺蟲劑。轉基因作物還能增加產品，例如抗蟲害轉基因玉米能增 產515。 轉基因技術也可用于改變食物的營養成分，例如減少土豆的水分， 這樣炸出來的土豆片更脆；降低植物油中的不飽和脂肪酸，能延長儲存期限。 轉基因西紅柿不僅容易運輸、保存，而且味道也更佳。菲律賓的國際水稻研究 院正在試驗“金水稻”，通過轉基因技術讓水稻制造貝塔胡蘿卜素（維生素A的 前體），有助于消滅在亞洲地區廣泛存在的維生素A缺乏癥。轉基因技術也可提 高水稻中鐵元素的含量，以減少亞洲婦女常見的貧血癥。,轉基因作物的歷史很短。1992年，中國種植了世界上第一批商用轉基因作 物轉基因煙草。1994年，美國市場上才首次出現了轉基因食品，一種軟化 緩慢的西紅柿。由于轉基因作物的巨大優勢，推廣非常快。到2000年， 全世界已有4420萬公頃的土地種植轉基因作物，其中美國占68，阿根廷占23， 加拿大占7，中國占1，其他國家占1。大豆、玉米、棉花和油菜是主要的 轉基因作物，在美國，有近一半的大豆、棉花，超過三分之一的玉米、油菜是轉 基因作物。美國超級市場上的食物制品中，約60含有轉基因的成分。在公眾的 反對聲中，目前這個發展勢頭已緩慢下來，特別是在工業化國家，轉基因作物的 種植面積有減少的趨向。美國雖然還沒有限制轉基因作物，但是由于美國是農產 品出口大國，歐洲、日本對轉基因作物進口的限制，也打擊了美國農民的積極性。,Transgenic tobacco plant with gene for firefly luciferase,關于基因工程的爭議,A.花那麼多經費研究基因工程，卻不能妥善照顧貧困的病人，不關心是否建立比較健全的公共衛生體系，來有效預防和治療疾病，或是訂定較完整的社會福利措施，這樣是否合乎倫理？ B.掌握基因工程科技的強國是否藉著優勢來宰制弱小國家？基因工程技術落入犯罪集團或野心家手中怎麼辦？提高了糧食產量，是否造成另一個資源分配不均的問題？,Arguments on Human Cloning,A.人是否該擁有基因專利權？是否可以轉讓出賣？新的基因組合的專利是屬於科學家(醫生)的，還是那個複製人的？如何保護專利權？如果有人在街上砍你一刀，取得血液細胞來複製人，那怎麼辦？在醫院裡，外科醫生偷偷用你的細胞複製人怎麼辦？,Arguments on Human Cloning Ethical Considerations,.複製人的養育責任是誰？複製人長大以後是否告知其出身？ .誰是他的父母？被複製人與被複製人的配偶？被複製人的父母？科學家(醫生 )？代理孕母？ .複製人推翻家庭婚姻制度，使得生育不再是家庭婚姻內的產物，他可能沒有自己的家庭。 .社會應該如何看待複製人？如何免受歧視？人權、社會地位、法律身分如何定義？,生命價值問題,.一個人有權決定另一個人的基因嗎？有權決定另一個人的生命嗎？ .複製人因為科學家(醫生)的疏忽造成的生理缺陷，導致心理不平衡的問題。 .社會一定偏好複製傑出或特殊人士(如愛因斯坦或希特勒)，所以複製人處處被別人拿來和被複製者比較，可能他沒有被複製者有極高的成就而感到挫折。複製人沒有自由選擇自己前途，活在被複製者的陰影，被物化，市場化。他選擇人生的方向、興趣、生活被剝奪，因為社會要求麥克喬丹的複製人打籃球，可是他 喜歡踢足球。他會羨慕別人沒有這些問題，並且怨恨自己的命運、怨恨科學家( 醫生)、怨恨被複製者. .製造出一堆體育高手，那麼運動會有何意義？製造出一堆品種優良的人類，那麼由自然生育的，而且品種較差的人、殘障的人，他們的生命有何意義？複製人顛覆了社會對人的價值的觀念，對人成功有新的解釋:那是因為他品種好啊！,醫療倫理、道德責任與科學研究問題,.複製自己來取得器官合乎道德嗎？這是不道德的，現行法律會以傷害罪來起訴。因為複製人不是他的備份，任他宰割的。退一步來問，用基因工程故意造出腦死的、無頭的、早死的複製人來移植器官合乎道德嗎？ .用基因重組產生一種類似人類的動物來移植器官，或是把動物注射人類基因 ，那麼這個動物要含有多少人類基因才能擁有人權呢？90%的人類基因嗎？ 80%呢？50%呢？ .造出四肢發達、頭腦簡單的人，來供人使役的不道德作法。 .診斷錯誤的責任承擔、複製人有缺陷的責任問題。 .代理孕母的道德問題。她是否淪為孵卵機器，把子宮出租十個月？,問：試管嬰兒剛出來的時候不為世人所容，但后來也漸漸被接受了，克 隆人在將來會不會也被人們接受呢？ 蘭德：試管嬰兒和克隆人有本質區別，試管嬰兒說到底還是精子和卵子 的結合，是一種自然的生育方式。我看不出克隆人有何必要和好處。我很高 興地看到，美國已經出臺了禁止克隆人的法律。 我還想說說細胞治療和干細胞研究。我絕對支持這種技術，它不是克隆 人，而是克隆細胞，比如克隆出一個可以發育成胰腺的細胞來治療糖尿病。 有人用克隆性治療來描述細胞治療，我認為克隆性治療這個詞非常不好，容 易和克隆人產生混淆。不幸的是，包括美國國會一些議員在內的很多人就鬧 不清楚細胞治療和克隆人的區別。 年月日英國自然雜志關 于人類基因組草圖論文的第一作者,問：世界上所有生物的基因一旦全部被破解，會不會一切都像玩拼圖一 樣？ 柯林斯：這是一個很嚴肅的問題，但它的答案也非常簡單，那就是“不 ”。我們現在就像一個無知的孩子，剛剛走進一個碩大的圖書館，圖書館中 擺著許許多多生命的天書，它們是自然花了幾十億年時間寫就的。我們現在