DB15T 2835-2022 馬駑巴貝斯蟲檢測 PCR法

ICS65.020.30CCSICS65.020.30CCSB41內 蒙 古 自 治 區 地 方 標 準DB15/T2835—2022PCR發布內蒙古自治區市場監督管理局發布內蒙古自治區市場監督管理局2023-01-082022-12-08DB15/T2835—2022DB15/T2835—2022II前 言本文按GB/T1.1—2020《準工導則 第部分標化件結和起規》起草。本文件由中華人民共和國呼和浩特海關提出并歸口。本文件起草單位：中華人民共和國二連海關、內蒙古自治區市場監督管理評審查驗中心。本文件主要起草人：陳少博、楊帆、王伊琴、常鴻、包勇敢、荊文魁、騰克、趙治國。DB15/T2835—2022DB15/T2835—2022DB15/T2835—2022每個反應管內的熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數。DB15/T2835—2022每個反應管內的熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數。馬駑巴貝斯蟲檢測PCR法范圍本文件規定了馬駑巴貝斯蟲PCR法和實時熒光PCR檢測方法。本文件適用于馬屬動物馬駑巴貝斯蟲病的分子生物學診斷。（GB/T6682 GB/T27403 1Ct1Ct值 cyclethreshold實時光 PCRreal-timePCR在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號的積累實時監控整個PCR擴增過程。聚合鏈反應 polymerasechainreaction；PCRDNA（deoxyribonucleicacidDNA經過DNADNA兩條鏈上的一段互補序列發生退火，接著在DNA聚合酶的催化下以4種dNTP（deoxyribonucleoside）DNA25～30106。馬駑貝蟲 babesiosiscaballi下列術語和定義適用于本文件。縮略語下列縮略語適用于本文件。bp:堿基對(basepair)CTAB：十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrithylammoniumbromide)DNA:脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）EDTA：乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)FAM:6-羧基熒光素(6-carboxyfluorescein)PCR:（polymerasechainreaction）TAMRA:(carboxy-tetramethyl-rhodamine)Tris：三（羥甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]GB/T6682DNACTAB。2。。蛋白酶K溶液(20mg/mL)。三氯甲烷。異丙醇。75%乙醇。Taq酶。dNTP（2.5mmol/L）。PCRbuffer。DNA分子量標準（DNAMarker）（50bp～500bp）。實時熒光PCR預混液。DNAB。DNA。空白對照：ddH2O。引物及探針:見表1。Tris-HCl2。。蛋白酶K溶液(20mg/mL)。三氯甲烷。異丙醇。75%乙醇。Taq酶。dNTP（2.5mmol/L）。PCRbuffer。DNA分子量標準（DNAMarker）（50bp～500bp）。實時熒光PCR預混液。DNAB。DNA。空白對照：ddH2O。引物及探針:見表1。表1 馬駑貝蟲測物探針檢測方法引物/探針序列（5’-3’）擴增片段PCR法上游引物（F）5′-CTCTCCAAAGTCTTAAGTAC-3′200bp下游引物（R）5′-CAGCAGATTGAAGACTAAG-3′實時熒光PCR法上游引物（F）5′-CTCTCCAAAGTCTTAAGTAC-3′200bp下游引物（R）5′-CAGCAGATTGAAGACTAAG-3′探針（P）5′-（FAM）-TGAGGCTAAGTACCAACCGCTG-（TAMRA）-3′PCRPCR法DNAADNADNA，DNAPCR法DNAADNADNA，DNADNAA260/A2801.7～1.9PCRPCR反應體系為50L，體系組成見表2。38 使用添加EDTA抗凝劑的采樣管無菌采集血樣。高速臺式離心機（最高轉速12000rpm）。（3000rpm）天平（感量0.01g）。單孔道微量移液器：0.5L～10L、10L～100L、20L～200L、100L～1000L。7 DB15/T2835—2022DB15/T2835—2022DB15/T2835—2022DB15/T2835—2022表2 PCR增應系成試劑名稱貯備液濃度反應體系體積L10×Buffer(含Mg2+)－5Taq酶5U/L0.25dNTP2.5mmol/L5上游引物（F）10mol/L2下游引物（R）10mol/L2模板－2ddH2O－補足至50檢測過程分別設陰性對照、陽性對照和空白提取對照。PCR預變性：95℃，3min；變性：95℃，30s；延伸退火：58℃，1min，35個循環；72℃延伸5min；4℃保存。用TBE電泳緩沖液配制成1.5%瓊脂凝膠。將瓊脂凝膠放入電泳槽中，加入1×TBE電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠。將5用TBE電泳緩沖液配制成1.5%瓊脂凝膠。將瓊脂凝膠放入電泳槽中，加入1×TBE電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠。將5L～8LPCR擴增產物分別和適量加樣緩沖液混合點樣。9V/cm恒壓電泳，直至溴酚藍指示劑遷移至凝膠中部。利用凝膠成像系統觀察電泳結果并記錄。質控對照應滿足以下條件，否則應重新實驗：200bp200bp200bp200bp200bpPCRPCR實時熒光PCR檢測DNA同7.1.1操作。PCR4反應體系體積為25L，見表3。表3 熒光量PCR增應系組成試劑名稱貯備液濃度mol/L反應體系體積LPCR反應預混合液—12.5上游引物（F）101下游引物（R）101探針（P）101模板—2ddH2O—補足至總體積為25檢測過程分別設陰性對照、陽性對照和空白提取對照。預變性：95℃，3min；變性：95℃，15s；延伸退火：58℃，1min，40個循環。在58℃時收集熒光信號值。質控對照應滿足以下條件，否則應重新實驗：Ct40.0；Ct40.0；Ct35.0。，2Ct40.0，2Ct35.01Ct35.0～40.0DNAPCRCtCt40.09防止交叉污染措施檢測過程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403中的規定執行。5附錄A（資料性）溶液配制及提取方法CTAB將5gCTAB，20.45gNaCl，3.03gTris，1.86gNa2-EDTA溶于200mL水中，用鹽酸調pH8.0后，定容至250mL，115℃高壓15min。CTAB稱0.2gCTAB,0.234gNaCl，定容至100mL，115℃高壓15min。1.2mol/LNaCl稱取28gNaCl，定容至400mL，115℃高壓15min。DNA64000rpm/min～5000r/min離心10min。1m）EP2m管0301200rm10min。600L～65064000rpm/min～5000r/min離心10min。1m）EP2m管0301200rm10min。600L～650LEP2CTAB1min。12000rpm離心10min350的1.2mol/LNaCl（2350L溶液。加入350L30min12000rpm10min。EP0.20min，12000rpm離心10min500L7512000rpm10min。，6015s～20s（。100LTEbuffer或DEPC77附錄B（規范性）馬駑巴貝斯蟲的目標擴增序列CTCTCCAAAGTCTTAAGTACCCTCT