細胞生物學實驗-步驟集

細胞生物學實驗

——步驟集PEG促細胞融合法的步驟（1）取雞血2ml+2mlAlsever液，再加入6mlAlsever液，混勻后制懸液。（可在4℃保存）（2）取(1)1ml+4ml0.85%的NaCl溶液，進行以下三次離心處理：①.1200r/min離心5分鐘。（去上清液，再加入至5ml的0.85%NaCl液）②.1000~1200r/min離心5分鐘。（去上清液，再加入至5ml的0.85%NaCl液）③.1000~1200r/min離心7分鐘。（3）將上步最后一次的沉降血球（去上清液后，約0.1~0.2ml），加入GKN液至1~2ml，使之成10%的細胞懸液。（4）取上述10%的血球懸液1ml，加入3mlGKN液，使每毫升含血球15000000個，即。（5）取（4）1ml+0.5ml50%的PEG液，或取（4）0.5ml+0.5ml50%的PEG液，或取（4）0.5ml+1.0ml50%的PEG液，混勻滴片，在常溫下2~3分鐘后，鏡下觀察。【細胞凝集反應實驗步驟】1.取土豆去皮塊莖2克，加10mlPBS緩沖液，浸泡24小時，浸出的粗體液中即含有可溶性土豆凝集素。2.抽取兔子靜脈血（加抗凝劑）1ml，加生理鹽水3ml，在1000r/min條件下，離心5分鐘。重復三次離心，最后按壓積紅細胞體積用生理鹽水配成1%的紅細胞懸液。3．分別用滴管吸取土豆凝集素和1%的紅細胞懸液各一滴，置雙凹片的左孔內，充分混勻。4．同時分別用滴管吸取PBS緩沖液和1%的紅細胞懸液各一滴，置雙凹片右孔內，充分混勻，作對照實驗。5.搖晃5-10分鐘后，觀察有無發生細胞凝集并置顯微鏡下觀察。

實驗步驟—蘇丹Ⅲ染色法斷頭法處死小鼠，置于解剖盤中，剪開腹腔，用鑷提起小腸將蓋玻片緊貼于腸系膜，并在其下部置一載玻片，用剪連同蓋玻片和其上粘的腸系膜取下，滴加甲醛鈣于有標本的載玻片處，使標本潤濕，固定20分鐘。吸蒸餾水滴入載玻片與蓋玻片之間沖洗，用滴管不斷吸去液體以去除固定液。用70%乙醇溶液代替蒸餾水重復步驟2的操作，再進行一次沖洗。用蘇丹Ⅲ染色30分鐘。吸去溢出染液，擦凈蓋玻片表面及周邊，顯微鏡觀察。

原代細胞(脾細胞）培養步驟1.取材：取小白鼠一只，采用斷頭法處死；清水洗小鼠并浸于75%酒精中滅菌3分鐘。取出轉入超凈潔凈臺內的解剖盤內，無菌操作打開腹腔。取出脾臟，去除其周圍的脂肪組織，鑷起脾臟用PBS液自上而下沖洗1—2次。轉入無菌玻璃培養皿中，待用。2．分離脾細胞：用滴管先向上述無菌玻璃培養皿中滴入PBS液30滴，再用“L”型針頭注射器在皿中吸取PBS液0.2ml，然后將其沿脾長軸方向注射入脾內（使脾臟膨脹以利于細胞散開）。用針尖在脾臟上扎眼，并用“L”針頭輕刮脾臟表面擠出脾細胞，用滴管吸皿中的PBS液沖脾臟并吹散刮出的脾細胞，稍傾斜并靜置1～2分鐘。吸取上述靜置后的脾細胞懸液上清部分放入Eppendorf管，并使量至1ml，以3000轉/分離心1～2分鐘。3．培養脾細胞：超凈潔凈臺中取塑料培養皿一個，用“槍（1ml）”加入細胞培養液2ml，并在皿蓋上畫上標記，待用。取上述離心后的Eppendorf管，在超凈潔凈臺內開蓋棄去上清液，用“槍（200μl）”吸取塑料皿中的培養液400ml加入棄去上清液的Eppendorf管中，用槍頭吹勻管底的脾細胞，然后吸取200ml脾細胞懸液接種于上述塑料培養皿中，混勻，然后放入37℃、5%CO2培養箱中培養。細胞生死狀態的鑒別——臺盼藍（TrypanBlue）法（1）試劑配制：用生理鹽水配制0.4%臺盼藍染液，備用。（2）細胞懸液制備：將生長有貼壁型細胞的培養瓶（皿）中的培養液倒入干凈試管中，向培養瓶（皿）中加入0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液l～2ml,靜置3～5min，待見到細胞變圓，彼此不連接為止，棄去混合消化液并將上述試管中的培養液倒回培養瓶中，用滴管輕輕吹打細胞，制成細胞懸液。（3）染色制片：取0.5ml細胞懸液放于干凈的試管中，加1-2滴（約0.1ml）染液，混合，2min后制成臨時裝片，鏡檢。（4）染色結果：死細胞染成藍色，活細胞不著色。或者， （3）染色計數：取0.5ml細胞懸液放于干凈的試管中，加1-2滴（約0.1ml）染液，混合2～5min，滴加少許染色后的細胞懸液于放有蓋片的血球計數板的斜面上，使懸液自然充滿計數板小室。注意不要使小室內有氣泡產生，否則要重新滴加。在普通光鏡10X物鏡下計數四個大格內的細胞數，壓線者數上不數下，數左不數右。（4）根據染色結果計算活細胞率：依據死細胞染成藍色、活細胞不著色的原則計數死細胞數和細胞總數，以如下公式計算細胞存活率：

II.伊紅Y（EosinY）法（1）試劑配制：用生理鹽水配制0.15%伊紅染液，備用。（2）細胞懸液制備：將生長有懸浮型細胞的培養瓶（皿）稍微傾斜，用滴管輕輕吹打細胞，制成細胞懸液。（3）染色制片：取上述細胞懸液少許，然后加入其等體積量的0.15%伊紅染液，混合，2min后制成臨時裝片，鏡檢或計數。（4）染色結果：死細胞染成桃紅色，活細胞不著色。III.美藍（MethvleneBlue）染色法（1）試劑配制：用蒸餾水配制0.1%美藍染液，備用。（2）染色制片：在干凈的載玻片中央加一小滴0.1%美藍染色液，然后再加一小滴酵母菌懸液，混合均勻，染色3～5分鐘后從液滴側面蓋上蓋玻片并吸去溢出的液體，制成水浸標本片，鏡檢或計數。（3）染色結果：死酵母菌細胞染成藍色或淡藍色，活酵母菌細胞不著色。細胞生死狀態的鑒別

a.平面圖(中間平臺分為兩半，各刻有一個方格網)b.側面圖(中間平臺與蓋玻片之間有高度為0.1毫米的間隙)

使用血球計數板直接計數時，先要測定每個小方格(或中方格)中的細胞數量，再換算成每毫升液體中細胞的數量。每毫升液體中細胞的數===每個大方格中的細胞數量╳10000╳稀釋倍數葉綠體分離的步驟1.選取新鮮嫩濾菠菜葉,去葉梗及粗脈,洗凈擦干，稱30克放于150ml0.35M.Nacl溶液中；2.將葉、液同裝入組織搗碎機中，勻漿3–5分鐘，轉速5000r/min；3.將勻漿用紗布(6層)過濾于500ml燒杯中；4.取濾液4ml在1000r/min下離心2min；5.取上層清液在3000r/min下離心5(沉淀為葉綠體和細胞核混合物)；6.將沉淀用2-3ml0.35Mnacl液懸浮；7.取一滴懸液滴片，加蓋片后顯微鏡下觀察；8.另取一滴懸液滴片，再滴加一滴0.01%的吖啶橙染料，混勻，蓋上蓋片，在熒光顯微鏡下觀察。

小白鼠肝細胞線粒體超活染色的步驟

1、用斷頭法處死小白鼠，置于解剖盤中，剪開腹腔，取小白鼠肝組織，選取邊緣較薄的肝組織0.5cm3，放入小燒杯中，用Ringer液沖洗去血污。

2、在干凈的凹面載玻片的凹穴中,滴加1/5000詹納斯綠B溶液，再將肝組織塊移入染液中，注意不可將組織塊完全淹沒，要使組織塊上面部分半露在染液外，這樣細胞內的線粒體酶系可充分得到氧化，易被染色。當組織塊邊緣被染成藍綠色即成(—般需染20～30min)。

3、吸去染液，用眼科剪將組織塊著色部分剪下重置小燒杯中，滴加

Ringer溶液0.5ml，用剪刀充分剪碎制懸液。

4、取上述細胞懸液滴片，加蓋玻片，高倍鏡下觀察。結果：肝細胞質中的線粒體被染成藍綠色（黃綠色）。小白鼠染色體標本制作步驟

取雄性小鼠以每克體重4μｇ注射秋水仙素，經14～16小時后，斷頭法殺死小鼠，取出睪丸用生理鹽水（0.9%的NaCl）洗去血污。放入裝有1ml0.3%KCl液的小燒杯中剪碎至呈乳白色。用銅網過濾到刻度離心管中，再加0.3%KCl液至4ml。37℃靜置30分鐘，進行低滲處理。以800～1000轉/分離心8分鐘。棄上清液，加入2ml甲醇·冰醋酸固定液（3：1），并用吸管至管底吹氣，輕輕打散細胞，固定8分鐘。再以800～1000轉/分離心8分鐘。棄上清液，加1ml固定液，再制成細胞懸液，固定5分鐘。取潔凈的低溫預冷載片，距載片10～15cm高度滴下2～3滴細胞懸液，從載片一邊向另一邊輕輕吹氣，并同時輕輕敲打載片，以使細胞均勻分布和促使染色體展開。用濾紙擦去載片上多余液體，空氣干燥或成文火干燥。染色體標本染色與觀察用Giemsa染色20～30分鐘，細水沖洗玻片背面，去多余染液，氣干。鏡檢：低倍鏡下尋找分散良好、染色適中的分裂相，高倍鏡或油鏡下觀察染色體形態并計數。人外周血染色體標本制備

(一)細胞培養

1．培養基的配制：

在超凈工作臺中，100ml培養基含以下成分和比例：

RPMI-1640

84ml

小牛血清

15ml

PHA

3支

肝素鈉

1ml

卡那霉素

終濃度為100單位/ml

以5%NaHCO3(無菌)或1NHCl調pH至7.2-7.4。

用刻度吸管將培養液分裝入培養瓶(10ml/瓶)，4℃備用。

2．采血：酒精消毒皮膚，肘靜脈采血0.3-0.5ml，立刻將注射針直接穿過培養瓶的橡膠塞，向10ml培養基中注入30-40滴全血，輕搖勻后置37℃恒溫箱培養。

3．培養：時間為68小時。培養期間，定期輕搖勻，使細胞充分接觸培養基。

4．秋水仙素處理：終止培養前2-4小時，在培養液中加入秋水仙堿(用1ml注射器5號針尖滴加2滴，使終濃度為0.07μg/ml)。

以上步驟均需無菌操作。

(二)染色體制備

1．收集細胞：將培養物全部轉入潔凈離心管中，以1000rpm離心8-10分鐘，棄上清液。

2．低滲處理：向刻度離心管中加入預溫37℃的低滲液8ml，用滴管混勻，置37℃恒溫水浴中低滲15-25分鐘。

3．預固定：低滲后加入0.5mlCarnoy’s固定液，輕輕混勻后1000rpm離心8-10分鐘。

4．一固定：棄上清液，加入5ml固定液，輕輕混勻，靜置20分鐘。1000rpm離心，棄上清液。

5．二固定、三固定：同一固定。

6．制懸液：棄上清液后，視細胞數量多少加入適量固定液制成細胞懸液。

7．滴片：吸取細胞懸液自10-20cm高滴在一張干燥潔凈的載玻片上，輕吹散，氣干。

8．染色：1:10Giemsa染色5-10分鐘，細水洗去多余染液，氣干。

9．鏡檢：低倍鏡下尋找分散良好、染色適中的分裂相，油鏡下觀察染色體形態并計數。

染色體組型實驗的步驟1.選擇染色體清晰的照相底片，用放大機制作出放大10倍的清晰照片。2.將染色體逐一剪下，并對每個中期染色體逐一進行測量，包括每條染色體的長度和每個臂的長度。3.根據測量數據，計算出每對染色體平均的相對長度、臂指數與著絲粒指數。4.把相對長度與臂指數相近者配成一對。5.參照相對長度、臂指數與著絲粒指數的數值，并根據標準順序，編排出染色體組型圖。6.用膠水或漿糊將每條染色體依照標準順序粘貼在實驗報告紙上。人類體細胞染色體的分類標準及其主要特征

小鼠的轉基因技術錄像Procedure1.Dissectionofoviducts.Recoveryoffertilizedeggs.Removalofcumuluscells.Procedure2.Recoveryof8-cellembryos.Removalofthezonapellucida.Constructionofaggregationchimeras.Procedure3.Dissectionofuteri.Recoveryofblastocycsts.Procedure4.DNAinjectionintopronucleitoproducetransgenicembryos.Procedure5.Nucleartransfer.Procedure6.Blastocystinjectionofembryonicstemcells.Procedure7.Vasectomizingmalemice.Procedure8.Oviducttransferofmanipulatedembryos.Procedure9.Vterinetransferofmanipulatedembryos.Procerdure10.Recoveryof6.5and7.5dayembryos.P