實驗四產物的載體克隆和轉化

實驗四產物的載體克隆和轉化第一頁，共三十六頁，2022年，8月28日重組DNA技術操作步驟第二頁，共三十六頁，2022年，8月28日基本原理目的基因的獲取DNA導入受體細胞外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構建重組體的篩選克隆基因的表達

第三頁，共三十六頁，2022年，8月28日主要步驟：①制備目的基因和選擇相關載體②目的基因和有關載體進行連接③重組的DNA導入受體細胞④DNA重組體的篩選和鑒定⑤DNA重組體的擴增、表達和其他研究第四頁，共三十六頁，2022年，8月28日

以質粒為載體的DNA

克隆過程第五頁，共三十六頁，2022年，8月28日

（三）PCR擴增特定基因

（四）人工合成一、目的基因的獲得——分

（一）從基因組文庫中獲得

（二）從cDNA文庫中獲得第六頁，共三十六頁，2022年，8月28日組織或細胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉化菌限制性內切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉化細胞內由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合從基因組DNA文庫獲取目的基因第七頁，共三十六頁，2022年，8月28日限制酶切位點限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫用隨機切割的真核生物染色體DNA片段構建基因文庫第八頁，共三十六頁，2022年，8月28日mRNAcDNA

雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫

反轉錄酶載體受體菌復制

從cDNA文庫獲取目的基因逆轉錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT第九頁，共三十六頁，2022年，8月28日化學合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列。第十頁，共三十六頁，2022年，8月28日幾種常用克隆載體的比較注：+表示可用；-表示不可用比較內容質粒λ噬菌體黏性質粒M13噬菌體克隆容量<10kb<22kb40～50kb<1kb基因組DNA文庫-++-cDNA文庫++--亞克隆+--+序列分析++-+E.coli表達++--二、載體的選擇與準備——選第十一頁，共三十六頁，2022年，8月28日三、DNA分子的體外連接——接（一）黏性末端（二）人工接頭的使用（三）加入同聚體尾（四）平端連接第十二頁，共三十六頁，2022年，8月28日（一）黏性末端第十三頁，共三十六頁，2022年，8月28日（二）人工接頭第十四頁，共三十六頁，2022年，8月28日（三）加入同聚體尾待克隆DNA片段重組質粒混合、退火空白質粒第十五頁，共三十六頁，2022年，8月28日（四）平端連接第十六頁，共三十六頁，2022年，8月28日5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′3′A(A)nA

A(A)nA

λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉移酶+dATP末端轉移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體5′3′5′第十七頁，共三十六頁，2022年，8月28日四、外源DNA導入宿主細胞——轉受體菌條件：安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(competent)

導入方式：轉化(transformation)轉染(transfection)感染(infection)第十八頁，共三十六頁，2022年，8月28日

外源基因導入宿主細胞后，篩選含有目的基因的陽性克隆并加以擴增。所用的方法主要有遺傳學方法、免疫學方法、核酸雜交法、PCR等。五、目的基因的篩選和鑒定——篩第十九頁，共三十六頁，2022年，8月28日1.借助載體上的遺傳標志進行篩選

(1)利用抗生素抗性標志篩選(2)利用基因的插入失活/插入表達特性篩選(3)利用標志補救篩選(4)利用噬菌體的包裝特性進行篩選2.序列特異性篩選

(1)RE酶切法(2)PCR法(3)核酸雜交法(4)DNA測序法

第二十頁，共三十六頁，2022年，8月28日（一）

遺傳學方法1.插入滅活法第二十一頁，共三十六頁，2022年，8月28日插入失活篩選帶有重組載體的克隆第二十二頁，共三十六頁，2022年，8月28日第二十三頁，共三十六頁，2022年，8月28日2.藍-白篩選（α互補）

許多載體（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調控序列和氨基端145個氨基酸的編碼序列。這個編碼區中插入了一個多克隆位點。這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主細胞。宿主和載體編碼的片段各自均無酶活性，但它們可以互補形成具有活性的β-半乳糖苷酶，使人工底物X-gal轉化成藍色的代謝產物，出現藍色的菌落。如果在多克隆位點上插入外源DNA片段，將使lacZ基因滅活，不能生成有活性的β-半乳糖苷酶，結果菌落呈現白色。第二十四頁，共三十六頁，2022年，8月28日α互補篩選（藍-白篩選）第二十五頁，共三十六頁，2022年，8月28日第二十六頁，共三十六頁，2022年，8月28日PCR產物的T載體

克隆和轉化

第二十七頁，共三十六頁，2022年，8月28日實驗目的：

學習T載體的特點和PCR產物的克隆方法。實驗要求：

掌握利用T載體克隆PCR產物的方法；復習連接實驗流程。技術應用：

目的基因片段與T載體DNA連接，達到克隆基因的目的。第二十八頁，共三十六頁，2022年，8月28日材料：目的基因片段（回收的PCR產物）藥品：pEMGT-Vector(Promega公司)第二十九頁，共三十六頁，2022年，8月28日

質粒（plasmid）是存在于細菌染色體外的小型環狀雙鏈DNA

分子。大小約為數千堿基對。常有1~3個抗藥性基因，以利于篩選。第三十頁，共三十六頁，2022年，8月28日質粒載體克隆的質粒載體允許外源的DNA插入，儲存。主要是DNA水平上的操作。基因表達的質粒載體

允許外源DNA的插入、儲存和表達。第三十一頁，共三十六頁，2022年，8月28日第三十二頁，共三十六頁，2022年，8月28日實驗原理普通Taq酶會在3′末端加一個A，這樣所有PCR產物都會在雙鏈DNA的3′端均有一個單鏈狀態的A；T-載體是線狀DNA片段，在DNA雙鏈的3′端均有一個單鏈狀態的T；二者在連接酶的作