蓮房多糖通過Wnt-β-catenin信號通路調(diào)控EMT抗肺癌轉(zhuǎn)移和侵襲的研究

蓮房多糖通過Wnt-β-catenin信號通路調(diào)控EMT抗肺癌轉(zhuǎn)移和侵襲的研究關(guān)鍵詞：蓮房多糖；Wnt/β-catenin信號通路；肺癌；EMT；轉(zhuǎn)移和侵襲1.引言肺癌是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其高發(fā)病率和死亡率主要歸因于腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移性。肺癌的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力與腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-MesenchymalTransition,EMT）密切相關(guān)。EMT是一種生物學(xué)過程，使正常上皮細(xì)胞失去極性、遷移性和黏附性，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂星忠u性和遷移能力的間充質(zhì)細(xì)胞。因此，抑制EMT過程對于肺癌的治療具有重要意義。近年來，天然植物多糖因其生物活性而受到廣泛關(guān)注。蓮房多糖是從蓮科植物蓮的種子中提取的一種多糖，具有多種生物活性，如抗氧化、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等。本研究旨在探討蓮房多糖如何通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路來抑制肺癌細(xì)胞的EMT過程，進(jìn)而降低肺癌的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。2.材料與方法2.1實驗材料2.1.1細(xì)胞株人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。2.1.2試劑與儀器2.1.2.1試劑(1)蓮房多糖粉末(LotusSeedPolysaccharide,LSP)，純度≥95%，購自Sigma公司。(2)DMEM培養(yǎng)基，Hyclone公司。(3)RPMI-1640培養(yǎng)基，Hyclone公司。(4)胎牛血清，Gibco公司。(5)胰蛋白酶-EDTA消化液，Gibco公司。(6)抗生素-鏈霉素，Gibco公司。(7)MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽），Sigma公司。(8)Wnt3a、β-catenin抗體，Abcam公司。(9)β-actin抗體，Abcam公司。(10)ECFP-Citrine標(biāo)記的β-catenin報告基因載體，Addgene公司。2.1.2.2儀器(1)CO2培養(yǎng)箱，ThermoFisherScientific公司。(2)倒置顯微鏡，Olympus公司。(3)流式細(xì)胞儀，BDBiosciences公司。(4)熒光定量PCR儀，Bio-Rad公司。(5)實時熒光定量PCR儀，Bio-Rad公司。(6)Westernblot儀器，Bio-Rad公司。2.2實驗方法2.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將A549細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%至90%匯合時，進(jìn)行實驗處理。2.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染使用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法將Wnt3a、β-catenin或空載體轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中。具體步驟如下：首先，將脂質(zhì)體與Wnt3a、β-catenin或空載體混合，形成復(fù)合物。然后，將復(fù)合物與A549細(xì)胞共孵育，并加入轉(zhuǎn)染緩沖液。最后，將細(xì)胞置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。2.2.3MTT法檢測細(xì)胞活力將轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞接種在96孔板中，每孔加入200μlDMEM培養(yǎng)基。將細(xì)胞置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4小時。然后，吸去上清液，每孔加入150μlDMSO溶解結(jié)晶。使用酶標(biāo)儀測定各孔的吸光度值（OD值），計算細(xì)胞存活率。2.2.4劃痕實驗將A549細(xì)胞接種在6孔板中，每孔加入2×10^5個細(xì)胞。將細(xì)胞置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，用無菌移液管在每個孔中央輕輕劃出一條直線，形成劃痕。然后將細(xì)胞置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。使用顯微鏡觀察細(xì)胞遷移情況，并拍照記錄。2.2.5免疫熒光染色將轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞接種在蓋玻片上，每孔加入2×10^5個細(xì)胞。將細(xì)胞置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，用PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次5分鐘。然后，將細(xì)胞固定在4%多聚甲醛中10分鐘。接著，用PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次5分鐘。然后，用0.2%TritonX-100處理細(xì)胞10分鐘。最后，將細(xì)胞與一抗（β-catenin抗體）孵育過夜，并用二抗（Cy3標(biāo)記的IgG）孵育1小時。使用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)β-catenin的表達(dá)情況。2.2.6實時熒光定量PCR分析收集轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞的總RNA，使用Trizol提取總RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。然后，使用實時熒光定量PCR儀測定β-catenin和內(nèi)參基因（GAPDH）的表達(dá)水平。反應(yīng)條件為：95℃10分鐘；40個循環(huán)：95℃15秒、60℃1分鐘；72℃1分鐘。使用相對定量分析軟件計算β-catenin相對于GAPDH的表達(dá)倍數(shù)。2.2.7Westernblot分析收集轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞的總蛋白，使用SDS電泳分離蛋白質(zhì)。然后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并使用封閉液封閉1小時。接下來，將膜與β-catenin抗體孵育過夜，并用二抗（HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG）孵育1小時。使用化學(xué)發(fā)光法檢測β-catenin的表達(dá)水平。使用ImageJ軟件分析條帶的灰度值。2.3數(shù)據(jù)分析所有實驗數(shù)據(jù)至少重復(fù)三次，采用GraphPadPrism軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。兩組間的比較采用t檢驗，以P<0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn)。3.結(jié)果3.1LSP對A549細(xì)胞活力的影響如圖1所示，與對照組相比，LSP處理組的A549細(xì)胞在48小時后的存活率顯著降低（P<0.05）。這表明LSP能夠抑制A549細(xì)胞的增殖能力。3.2LSP對A549細(xì)胞遷移能力的影響如圖2所示，與對照組相比，LSP處理組的A549細(xì)胞遷移距離明顯縮短（P<0.05）。這表明LSP能夠抑制A549細(xì)胞的遷移能力。3.3LSP對A549細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響如圖3所示，與對照組相比，LSP處理組的A549細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），而N-cadherin和Vimentin表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。這表明LSP能夠抑制A549細(xì)胞的EMT過程。3.4LSP對A549細(xì)胞β-catenin表達(dá)的影響如圖4所示，與對照組相比，LSP處理組的A549細(xì)胞中β-catenin表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。這表明LSP能夠抑制A549細(xì)胞中的Wnt/β-catenin信號通路。3.5LSP對A549細(xì)胞EMT相關(guān)基因表達(dá)的影響如圖5所示，與對照組相比，LSP處理組的A549細(xì)胞中EMT相關(guān)基因（如Snail、Slug和Zeb1）的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。這表明LSP能夠抑制A549細(xì)胞的EMT過程。4.討論4.1LSP對A549細(xì)胞EMT過程的影響機(jī)制本研究發(fā)現(xiàn)，LSP能夠通過抑制A549細(xì)胞的EMT過程來降低肺癌4.討論4.1LSP對A549細(xì)胞EMT過程的影響機(jī)制本研究發(fā)現(xiàn)，LSP能夠通過抑制A549細(xì)胞的EMT過